Figura 1. Esquema del preparado y de los protocolos experimentales. C: control. CI: control isquémi...

Figura 2. Trozos de corazones representativos y valores medios del tamaño del infarto, expresado co...

Figura 3. Cambios de la presión desarrollada del ventrículo izquierdo (PDVI, panel A) y de la máx...

Figura 4. Cambios de la presión diastólica final del ventrículo izquierdo (PDFVI), expresada en m...

Figura 5. Panel A. Cambios durante la isquemia-reperfusión de la máxima velocidad de descenso de l...

Introducción

Entre las enfermedades cardiovasculares, la enfermedad isquémica es la causa más frecuente de muerte en hombres y mujeres, y es responsable de más de la mitad de todos los eventos cardiovasculares1. Estudios epidemiológicos muestran que en la mujer premenopáusica el comienzo de la enfermedad isquémica cardíaca ocurre, en promedio, 10 años más tarde que en el hombre, teniendo lugar el infarto miocárdico 20 años después2,3. A pesar de estos datos, existe escasa información sobre la respuesta del miocardio a una lesión aguda de isquemia-reperfusión en hombres y mujeres4,5. A nivel experimental, en la mayoría de las investigaciones se muestra que los corazones de animales machos son menos resistentes a los eventos isquémicos6-8.

El posacondicionamiento isquémico (PCI), propuesto por Zhao et al. es una estrategia de protección que se basa en que la aplicación de episodios breves de isquemia-reperfusión al comienzo de la reperfusión disminuiría las alteraciones posisquémicas. El PCI representa una estrategia extrapolable al ámbito clínico, particularmente a pacientes con un infarto agudo de miocardio sometidos a terapias de reperfusión9,10. Numerosos trabajos realizados en distintos modelos experimentales en animales machos proponen al PCI como una herramienta para disminuir la muerte celular posisquémica. En una revisión reciente se mencionan estos estudios y se analizan los posibles mecanismos responsables de la cardioprotección dada por el PCI11. Sin embargo, los datos bibliográficos acerca de los efectos del PCI en animales hembra no son concluyentes.

Por lo tanto, los objetivos de este estudio fueron: 1) determinar la función sistólica y diastólica de corazones aislados de ratas Wistar macho y hembra sometidos a 30 min de isquemia global y 60 min de reperfusión; y 2) evaluar los efectos del PCI en los corazones de ambos sexos.

Materiales y métodos

Se utilizaron ratas Wistar machos (M) y hembras (H) de 4-5 meses de vida de las cuales, una vez anestesiadas, se aisló la aorta y a través de una cánula se conectó a un sistema de perfusión de Langendorff. El corazón fue perfundido con una solución de Ringer compuesta por: ClNa 120 mM, Cl2Ca 1,35 mM, ClK 4,7 mM, SO4Mg 1,2 mM, CO3HNa 20 mM y glucosa 11,1 mM, termostatizada a 37°C y equilibrada a pH=7,40. La frecuencia cardíaca se mantuvo constante en un valor de 280 ± 10 lat/min. Para evaluar la actividad mecánica se colocó un balón de látex en el ventrículo izquierdo y se conectó a un transductor de presión (AD Instruments) que permitió medir la presión del ventrículo izquierdo (PVI) (Figura 1). El globo de látex se llenó con un volumen de agua suficiente para lograr una presión diastólica final (PDFVI) entre 8-12 mmHg. La presión de perfusión coronaria fue ajustada a valores entre 60 y 75 mmHg y el flujo coronario entre 10 y 12 ml/min. La PVI fue adquirida usando un conversor analógico-digital y el programa de adquisición Chart V4.2.3 (AD Instruments).

Protocolos experimentales

Después de un período de estabilización de 20 min, los corazones de los animales de ambos sexos fueron sometidos a los siguientes protocolos (Figura 1): 1) Control (C, n=6): los corazones fueron perfundidos con solución Ringer durante 90 min; 2) Control isquémico (CI, n=8 M y n=6 H): se realizó una isquemia global (IG) de 30 min (por interrupción total del flujo coronario) y se reperfundió durante 60 min; 3) Posacondicionamiento isquémico (PCI, n=7 M, n=6 H): después de la IG de 30 min y al comienzo de la reperfusión se realizaron 3 ciclos de IG-R de 30 segundos cada uno y luego se siguió la reperfusión hasta completar los 60 min.

Parámetros medidos

Determinación del tamaño del infarto

Al término del período de reperfusión el corazón fue retirado del sistema de perfusión de Langendorff y el ventrículo izquierdo (VI), una vez pesado, se congeló a −20 ºC por una hora. Al cabo de este tiempo el VI fue cortado en trozos de 2 mm de espesor los cuales fueron pesados y sumergidos en una solución al 1% de cloruro de trifeniltetrazolio (TTC) durante 15 min. El tamaño del infarto se expresó como porcentaje del área de riesgo (área total).

Función sistólica

La función sistólica fue evaluada a través de la presión desarrollada del VI (PDVI) que se calculó restando a la PVI la PDFVI y de la velocidad máxima de ascenso de la presión ventricular (+dP/dtmáx).

Función diastólica

a. Rigidez diastólica. Puesto que nuestro modelo experimental es una preparación isovolúmica, la PDFVI fue usada como índice de rigidez diastólica ventricular.

b. Relajación isovolúmica. Para evaluar la relajación isovolúmica realizamos las siguientes medidas:

1. La velocidad máxima de descenso de la presión ventricular (–dP/dtmáx);

2 El tiempo hasta alcanzar el 50% de la presión pico (t50);

3 La constante de tiempo de relajación (τ). Esta constante fue calculada usando una ecuación monoexponencial con asíntota variable:

P = P0 × e−t/τ + Pb

donde P es la presión ventricular medida desde el –dP/dtmáx hasta que la PDFVI alcance el valor de 5 mmHg; Pb es el valor asintótico; P0 es el valor de la presión ventricular a tiempo=0 durante la relajación; t es el tiempo que dura la relajación y τ es la constante de tiempo de relajación.

Análisis estadístico

Los resultados se expresaron como la media ± error estándar. Para establecer las diferencias significativas entre dos grupos experimentales se utilizó la prueba de t de Student. Para la comparación de más de dos grupos se utilizó análisis de varianza (ANOVA) de una vía seguido del test de Newman-Keuls para comparaciones múltiples. En todos los casos el valor de 0,05 se consideró como el límite de significación estadística.

Resultados

En el grupo C el valor promedio del tamaño del infarto (TI) fue aproximadamente 1,5%. Después de la isquemia-reperfusión el TI aumentó, siendo significativamente mayor en los M que en las H (40 ± 2% vs. 29 ± 4%). El PCI disminuyó significativamente el TI en ambos sexos, alcanzando un valor de aproximadamente 15% (Figura 2).

La recuperación posisquémica de la función sistólica fue significativamente mayor en H que en M. En el grupo CI, los valores de PDVI y +dP/dtmáx al final de la reperfusión fueron mayores en H que en M (55 ± 3% y 59 ± 7% para H y 19 ± 4% y 23 ± 5% para M; p<0,05). En los corazones posacondicionados (grupo PCI) la recuperación posisquémica de la función sistólica aumentó significativamente en M y no se modificó en H. En este grupo y al final de la reperfusión, los valores de PDVI y de +dP/dtmáx fueron de 62 ± 6% y 64 ± 9%, respectivamente, para M, y de 59 ± 5% y de 64 ± 4%, respectivamente, para H (Figura 3 A y B).

La PDFVI aumentó durante la isquemia y la reperfusión, adquiriendo en M valores significativamente mayores que en H. Es decir, la rigidez diastólica posisquémica fue mayor en M que en H. En el grupo CI y al final de la reperfusión, la PDFVI fue de 50 ± 4 mmHg y 26 ± 8 mmHg para M y H, respectivamente. El valor preisquémico de PDFVI fue de aproximadamente 11 mmHg para ambos sexos. En los corazones posacondicionados (grupo PCI), la rigidez diastólica disminuyó sólo en M, alcanzando valores semejantes a los observados en H. En este grupo y al final de los 60 min de reperfusión, la PDFVI fue de 33 ± 4 mmHg para M y 31 ± 4 mmHg para H (Figura 4).

Con respecto al –dP/dtmáx también se observaron valores significativamente mayores durante la reperfusión en H que en M. A los 60 min de reperfusión, el valor promedio fue 54 ± 7% para H y 21 ± 4% para M. De manera similar a lo que ocurrió con los parámetros anteriormente mencionados, el PCI aumentó la recuperación del –dP/dtmáx solamente en los M sin modificarse en las H (Figura 5 A).

El valor preisquémico de t50 en M y en H no fue diferente (58 ± 1 ms y 55 ± 3 ms, respectivamente). A los 5 min de la reperfusión, t50 aumentó ligeramente en los M sin alcanzar significación estadística. Sin embargo, en las H no se observó ningún cambio. Estos valores no se modificaron en los corazones posacondicionados de ambos sexos. En cuanto a la constante t, en M, desde un valor preisquémico de 28 ± 3 ms, aumentó a 48 ± 5 ms a los 5 min de la reperfusión, siguió elevado a los 10 min y paulatinamente se normalizó al finalizar dicho período. Sin embargo, en H t no se modificó durante toda la reperfusión. El PCI anuló los cambios observados en los M y en H no mostró cambios (Figura 5 B).

Discusión

En este trabajo observamos que la aplicación de un período severo de isquemia global (30 min) seguido de 60 min de reperfusión a corazones aislados de ratas adultas jóvenes produjo un daño miocárdico mayor en machos que en hembras. Esto es evidenciado por un mayor tamaño de infarto, una menor recuperación de la función sistólica, un aumento de la rigidez diastólica durante la reperfusión y un empeoramiento de la relajación isovolúmica. Otro hallazgo interesante es que, en los corazones de M, el posacondicionamiento isquémico logró atenuar la muerte celular y la disfunción sistólica y diastólica posisquémica. En cambio, en H, esta intervención solo logró disminuir el tamaño del infarto sin modificar la respuesta contráctil durante la reperfusión.

Con respecto a la respuesta a la isquemia de M y H, aunque algunos estudios no observaron diferencias en el tamaño del infarto originado por episodios de isquemia aguda, la mayoría de las investigaciones experimentales muestran que los corazones de hembras toleran o poseen una mayor resistencia frente a la isquemia-reperfusión6-8,12,13. Nuestros datos concuerdan con estos últimos resultados. Los mecanismos responsables no han sido aún dilucidados y los datos de este estudio no nos permiten dar conclusiones al respecto. No obstante, mencionaremos algunas de las hipótesis que hasta el momento se han considerado. Algunos autores reportan diferencias en el acoplamiento excitación-contracción y en los procesos de manejo del calcio en los cardiomiocitos entre hombres y mujeres14,15. Diferencias en las vías dependientes de quinasas tales como proteína quinasa B (PKB o Akt) y/o proteína quinasa C (PKC), producción de especies reactivas del oxígeno (ROS), así como diferencias en la apoptosis y la autofagia entre machos y hembras y en los mecanismos dependientes del óxido nítrico, son algunos de los mecanismos propuestos6,16-19.

Con respecto al PCI en machos y hembras, la bibliografía existente hasta la actualidad es escasa y contradictoria. Así, un estudio previo realizado en corazones aislados de rata macho y hembra muestra que la aplicación de distintos protocolos de PCI no mejora la tolerancia a la isquemia-reperfusión ni disminuye el tamaño del infarto20. Otra investigación demuestra que el PCI reduce el tamaño del infarto después de 10 min de reperfusión solo en hembras21. Resultados obtenidos por Crisostomo et al. muestran que el PCI es cardioprotector en rata macho pero no en hembra después de 25 min de isquemia, resaltando que los beneficios del PCI dependen de la duración de la isquemia22.

Conclusiones

Nuestros datos evidencian la existencia de una sensibilidad diferente del miocardio de rata macho y hembra a la aplicación de un período severo de isquemia global. Este dimorfismo sexual se manifiesta por una mayor disminución en la recuperación de la función sistólica y diastólica posisquémica en el macho que en la hembra. Los datos de PCI también muestran que esta herramienta cardioprotectora fue más eficiente en machos que en hembras. Estudios posteriores serán necesarios para dilucidar los mecanismos responsables de todas las diferencias observadas.

Agradecimientos

Los experimentos fueron realizados utilizando el subsidio asignado al proyecto 11/M169 de la Universidad Nacional de La Plata, Facultad de Ciencias Médicas, dirigido por la Dra. Susana Mosca.

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Efectos del posacondicionamiento isquémico en corazones aislados de machos y hembras

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